更多http  sioc  -journal  .cn  chub  hxxb  20040274.pd   百度更多http   sioc   -journal   .cn   chub   hxxb   20040274.pd   文档，资料下载

http://sioc-journal.cn/chub/hxxb/a20040274.pdf
文件大小：8292字节


内容摘要：

!""#年第$!卷
第%期,!&#'!&(
化学学报
)*+)*,-.-*)/-0-*)
1234$!,!""#
024%,!&#'!&(
复合式蝎形引物实时定量检测端粒酶延伸产物
黄艳萍!,"孔德明!张晓滨!沈含熙!,!宓怀风!
(!南开大学化学学院高分子功能材料吸附与分离国家重点实验室天津%"""&5)
("天津医科大学药学院天津%"""&")
摘要针对端粒酶延伸产物中靶基因序列的特殊性,开发了一种可产生荧光的复合式蝎形引物,该引物的67端带有可特
异性检测靶基因的探针序列,8*9阻断剂将其与引物序列连接4当复合式蝎形引物延伸,探针序列与同一分子内的靶基因
杂交,荧光信号产生4运用该技术,建立了定量检测端粒酶延伸产物的实时荧光8*9方法4该法可在快速8*9循环条件下,
对"456'546":5"%;范围内的样品进行定量检测,线性相关系数#! "4@@@!4该法操作简便,无需8*9后额外的检
测步骤4
关键词复合式蝎形引物,端粒酶,实时检测,聚合酶链式反应(8*9)
!"#$%&'(")*#+&'&#&',"-..#/012"$0("3#."4305*6&7.'+8
&9":*;$"/1 &+61%(,@1!/A1/BCCCDC)
->.&3#6&+2RSKTFUFTV;WGKVRKXPKDTK2UVK32)SW2\KK3K%
GW2PS,_[2RK3KDGV[FR;RV[KR;RT2WSF2DSWFV[KKZVKDYKYYPS3KZRT2WSF2DSWF2UVK32"456'546":5"%;PDYKWU;RVT]T3FDGT2DYFVF2DR4+[K3FDK;WT2WWK3;VF2DU;TV2W#! "4@@@!4+[KRSKTFUFT,RF "/@035.YPS3KZRT2WSF2DSWF端粒酶是一种独特的具有逆转录酶功能的核糖核蛋白
酶,主要功能是合成端粒序列(++)BBB)并维持端粒序列长
度(5"'6"^\)4由于其在良性肿瘤和正常细胞中几乎无活
性,而在大多数恶性肿瘤细胞中均能检测到其活性,因此,端
粒酶被公认为是目前最广谱的恶性肿瘤的预警标志物,其活
性对大多数恶性肿瘤的诊断均具有较高的敏感性和特异
性[5]4
检测端粒酶活性的"端粒重复扩增法"(+K3K;志物的重要手段4最初的+9)8法分为转录和聚合酶链式反
应(823]90)的片段为模板,在适宜的寡核苷酸链的末端添加端粒
重复序列,生成端粒酶延伸产物;随后,对延伸产物进行8*9
扩增,扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后放射自显影检测
""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
4
!OE<;F3:[ZR[KDcK]2P4T2<
9KTKFbKY/KSVK<\KW!#,!""%;WKbFRKYJKTK公司),"E0)(B型荧光分光光度计(日本,
岛津),H*&(B0E0I0HB型微量荧光池(英国,@1.,6.C,.6J)&
!&"试剂
9@$由探针引物($, K-$,23-,,$$):E#50)L0
[%%%!##]
'
0阻断剂0##!%%A!%A#A%#A#A!!0'L(阻断剂为三
个碳原子的碳链,带下划线的为探针序列)与猝灭探针
(I:-6>M-,;, K-,I$):)L0[!!#AAA]
'
0'L09#C%NO所组成,由
上海申友生物技术有限责任公司合成&上游引物:)L0
##!%%A!%A#A%#A#A!!0'L,下游引物:)L0A%A%AA[%!!0
#%%]
'
%!##%%0'L(划线部分为错配的碱基,这三个错配碱基
的引入是为了避免引物二聚体的$%"产物对结果造成的影
响)[HB]以及人工合成的寡核苷酸(端粒酶延伸产物)"):)L0
##!%%A!%A#A%#A#A!!#A[AA!!#A]
(
0'L,由上海生工生物
技术工程有限公司合成,其它生物试剂亦购自于该公司&
!&#步骤
H&'&H$%"反应条件
每管反应液包括P&)!O的HBQ!"#$缓冲溶液[PBB
33 /RO!,2=0S%/(;ST7&'),HB33 /ROUA!#,*'B33 /RO
V%/,B&B)W!X--60PB,H3YR3OC@#],BZH'!OJ[!$=
(J#!$,J!!$,J%!$,JA!$,各HB33 /RO),PF!.4聚合酶,
H&)!O5Y%/
P(P)33 /RO),H&(!O上游引物(+)!YR3O)或
B&)!O$$RP&)!OI$(P)!3 /RO),P&7!O下游引物('*!YR
3O)和P!O不同浓度"),最后加水至总体积为P)!O&扩增
条件为:8)\,'326,H个循环;8(\'B=,*B\'B=,轮流
P+个循环&
H&'&P非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
取P)!O的$%"产物,进行HPW的非变性聚丙烯酰胺凝
胶电泳(电压H'BG)P]'M至溴酚兰染料泳带移动至凝胶
前沿,电泳结束后用溴化乙锭(-1M2J2:3K, 32J-)染色,于凝胶
成像系统上观察并拍照&
H&'&'荧光熔融曲线
反应液总体积为P)!O,由!"#$缓冲溶液,$$,I$及
5Y%/
P(浓度见步骤H&'&H)组成&熔融曲线在荧光定量$%"仪
上完成&条件为:8)\H)=,*B\PB=,从()\到7B\缓慢
升温PB326,在此升温阶段连续检测荧光&
"结果与讨论
"&!反应原理
本实验是在V23等[HB]建立的改进版!"#$法基础上设
计9@$,并以人工合成的寡核苷酸("))作为模板,建立了
9@$实时定量检测端粒酶延伸产物的新方法&")相当于上
游引物在端粒酶作用下延伸,产生的带有)个端粒重复序列
的端粒酶延伸产物&实验中,在不改变其它条件的情况下,将
$%"扩增体系中的上游引物用9@$代替&该引物由两条单标
记的寡核苷酸链组成,其中一条为$$链,该链在上游引物的
)L端加入标记有荧光基团E#5的探针部分,探针序列为可
检测端粒重复序列的[%%%!##]
'[HH]&引物序列与探针序列之
间用$%"阻断剂($%"0K/ >^-,)(本文选用的是三个碳原子的
碳链,其长度与一个碱基相当)连接,以阻止$%"产物沿探
针序列延伸;另一条为I$链,由标记有猝灭基团9#C%NO的
探针互补序列组成,用于猝灭$$的荧光&9@$具有引物和探
针的双重功能&在对端粒酶延伸产物(图H,#)进行$%"扩
增时,下游引物首先从反向延伸得到模板(图H,C)&然后
9@$在!.4酶的推动下沿该模板延伸,形成带有探针序列的
扩增产物(图H,%)&在$%"荧光检测步骤中,9@$的探针序
列与同一分子内的靶基因以分子内杂交的形式结合在扩增
产物的内部(图H,9)&我们使用52>M.-/_:^-,的"3' /J(版本
'&H)"软件[HP]分析,发现探针序列与同一分子内最靠近它的
端粒重复序列杂交,并倾向于形成带一个长尾巴的分子灯标
(3 /->:/.,K-.> 6)结构,这种稳定的茎环结构导致$$链与
)+P[ &'黄艳萍等:复合式蝎形引物实时定量检测端粒酶延伸产物
!"链彻底分离,荧光基团发出荧光#由于每个"$%扩增产
物带有一个荧光探针,因此无论端粒酶延伸产物上带有多少
个端粒重复序列,一个延伸产物只能对应一个荧光基团,从
而解决了实时检测端粒酶延伸产物的定量问题#
图!&'"的工作原理
"#$%&'!())*+,-./0.,1234&'"
()(*+,的熔融曲线
从图5的荧光熔融曲线可以看出,当溶液温度升高时,
所设计的&'"具有双链核酸的熔融特点#即低温时,!"与
""中的探针部分相互杂交,使得荧光基团与猝灭基团靠近,
抑制了荧光的产生#高温时,杂交解链,导致荧光基团与猝灭
基团彻底分离,荧光基团恢复荧光#从对应的导数图谱可以
得到,&'"的熔融温度!
6
789#8:#由此可以得出,实时定
图(&'"的荧光熔融曲线(;)及对应的导数曲线(5)
"#$%&'(./ 0=-@2(;)*/A>B2A2-.@*>.@20=-@2(5)
34&'"
量"$%时,荧光检测阶段的温度须小于此!
6
值,使得未参
与反应的""能充分地与!"结合,以保证&'"可以稳定存
在,从而体系的背景荧光保持在一个较低的水平上#
(#-可见吸收光谱
我们对"",!"及&'"的可见吸收光谱进行了考察#结
果表明,与""相比,&'"在荧光基团-*34&'"
;—"";5—!";I—&'"
()./,与,,的浓度比对猝灭效率的影响
猝灭基团对荧光基团的猝灭效率是影响荧光探针性能
的重要指标之一#猝灭效率越高,探针的检测效果也就越好#
我们在;#86631KGC $1
5的L%("缓冲溶液中,固定""的浓
度为M#I!631KG,加入不同浓度的!",在98:温育86./后,
逐渐冷却至室温,测其荧光值#根据下列公式:"
44
7[;N
(#
O
N#
J)K(#
=O
N#
J)]P;MMQ[;D]计算猝灭效率,式中#
=O,
#
O和#
J分别代表了"",""与!"以及缓冲溶液的荧光强
度(表;)#从表中可以看出,当!"与""的浓度比R;时,体
系的猝灭效率始终保持在9HQ以上#由于端粒酶延伸产物
序列的特殊性,所设计的探针序列与"$%下游引物序列相
似#为了避免!"与下游引物的相互作用,影响猝灭效率#实
验中,我们选择!"与""的浓度比为8S;,务使""链与!"
链充分结合,以保证&'"具有高效的猝灭效率和良好的检
测效率#
()0*+,与上游引物扩增产物的比较
&'"是在L%("法上游引物的基础上构建的#为了考察
其附带的探针结构是否会影响引物的引导延伸作用,进而影
TH5化学学报U31#T5,5MMD
表!!"#的猝灭效率
"#$%&!$%&'()*'+&,,*(*&'(*&-.,!"#
!($#)/!(##)0/01/02/03/04/0
"
,,
56715672567856785679
响#:;扩增7我们以;4为模板,以水为阴性参照,分别用
!"#或上游引物对其进行#:;扩增,每个模板进行两次实
验,扩增后产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳条带分析(图3)7从
图中可以看出,在无模板存在时,!"#和上游引物均产生引
物二聚体,但!"#产生的引物二聚体条带靠下,不干扰产物
条带;在有模板存在的条件下,上游引物得到两条扩增产物
条带(4和48=>,分别为下游引物结合在;4的10位碱基
和16位碱基处的产物)[0).C&-*-.,#:;>C.D%(B-%-*'+%>-BC&EF>C*F&C
(0 3).C!"#(4 9)
0,1,4,8—GEB&CE-C&,&C&'(&;2,3,6,9—;4E-B&F>AEB&
-./实时荧光012条件的优化
!"#中的探针序列是以分子内杂交形式形成发夹结构
而产生荧光,该发夹结构的形成可在不到0!-时间内完
成[03],且具有较高的稳定性7因此可以在快速循环(即53H
<-,延伸温度<-,检测温度2-,0<<个循环)的条件下进行
#:;扩增7我们固定延伸温度为8温度(42,4<,34H)对实时荧光#:;定量的影响7结果显
示,只有当检测温度设为34H时,不同浓度下荧光强度随
#:;循环数的改变才能真正符合定量#:;扩增规律(图4)7
即在一定的循环数之间,荧光强度呈现指数级改变7在高循
环数时则趋于平台,并且起始浓度越高,荧光信号进入指数
增长阶段时所需的#:;循环数(#
I)就越少7这是由于检测
温度较高时,未参与反应的##的荧光不能完全被猝灭,从而
干扰了定量7同时实验中还发现,引物二聚体的信号在3<个
循环之后产生7并在此以后,模板量与其相应的#
I
值不再
呈线性关系7因此,我们选择3<为最大循环数7经过优化的
实时#:;扩增条件为:54H2F*',0个循环,53HA.B-%-*'+!"#,.CM%E'B*BEB*N&E--EO.,;4
(EF.AJ!K)
-74定量检测
在优化的实时荧光#:;条件下,将;4进行0<倍量的
连续稀释,取8个浓度,范围分别在<704 074!K之间,用!"#进行实时定量#:;检测7结果显示,在<704
074I值
有良好的线性关系(图8),线性相关系数$1为<75551;灵敏
度为<704EF.AJ!K7
图/!"#的I;L#法检测;4的标准曲线
()*+,&/"BE'DECD(%CN&,.CD&B&(B*.'.,;4%-*'+B)&!"#=OI;L#
E--EO
5结论
在分子灯标的基础上,Q)*B(.F=&等[04,08]开发出了蝎形
引物,将杂交检测模式由分子间杂交转化为了分子内杂交,
使其更适用于#:;产物的快速检测7但它没有摆脱分子灯
标及IEMRE'探针的固有局限,即属于双标记探针,这不仅为
探针的设计与合成带来了一定的困难,同时也极大地增加了
实验成本7为此,".A*'E-等[06]在蝎形引物的基础上又进行了
改进,开发出了单标记的复合式蝎形引物7
661S.72黄艳萍等:复合式蝎形引物实时定量检测端粒酶延伸产物
由于端粒酶延伸产物结构的特殊性,我们选择复合式蝎
形引物对其进行实时定量检测的同时,在原有复合式蝎形引
物结构的基础上,将!"#阻断剂由聚六乙二醇($%&)改为价
廉的"
'基团,并采用非荧光猝灭剂(()*"+,)标记猝灭探
针,以降低背景-改进后的(.!实时定量!"#技术将!"#敏
感性和探针的特异性相结合,能够准确,特异,敏感地对合成
的端粒酶延伸产物进行定量分析,无须额外检测步骤,克服
了现有检测方法存在的操作繁琐,交叉污染以及放射性危害
等不足-该方法的建立为临床端粒酶活性的检测奠定了良好
的基础-
本文为"纪念柳大纲先生诞辰一百周年"征文
!"#"$"%&"'
/&012340,5-!-;607389,6-%-;.81:,;-6-!"#$%&'(%
)*+,-,./01'23$,-,./())(,45,-#-;$10F4:,"-
*-;64A9,5-(-;$D,!-,-;"DG74FFD,&-5-;607389,6-
%-;647207H8,.-,-;.81:,;-6-6+#'*+'*++,,788,-;N18101,$-;OP4,
N-;+DA87 M01,N-9%!3*+'"&':%!-#*%)*+,-%*++-,57;,
''Q-
R&4F 727,.-;"1FP727,)-;*4H840727,,-;"1S1HH7DF7,.-;
!1BB13F7,5-;L0F12PD,"-!-#*%!<'2%*++.,44,TU48101,$-;@10PD24,&-;@1B1042CD,O-;$D8 12,#-;-
=#,$'+ ':*+++,78,TT<-
V.B19 107,O-;NDC4A,.-;(M22,"-*-;*10PDA,N-;-;)01P7,
;-@*3-%=#,+<'2%())),7A7,WI-
QXM,.-;$4,5-;+M,$-;"17,X-;N12,X-;,M,*-;.8M,
*-@*3-%=#,+D23,(-K5-;&M,,-;.842,$-KX-;57,$-KY-@+$3!D23,(-K5-;.842,$-KX-!<#*%9%!7 ,@-6-;6M,Y-C +-'#+@+#D:&':%*++-,7E,-Y-;%07CAAD2K
,72PA90Z ,%-;;MA9,N-;#DDA,&-C +-'#+@+#D:&':%*++.,
78,'VT/-
/-
5-@*3-%!01 40,Y-#-C3$%=#,$'+<*,-%*++0,54,'I'-
/T6879HD J4,(-;N841C40,;-;&M:,.-!-;*0DE2,N-;,799F4,
.-C3$%=#,$'+<*,-%*+++,5F,WIR-
/VN84FE4FF,@-;57FF7239D2,.-;.DF721A,)-;*DD98,;-;*0DE2,
N-C +-'#+@+#D&':%())),7A,'QT442,"-;54FFD0,;-5-;
@7HDF,;-N-&-;N84FE4FF,@-;*0DE2,N-C +-'#+@+#D:&':%
())*,7B,4=V-
()I'I=WQ<化学学报]DF-V<,